Установление эндотоксинов при помощи LAL-теста. Кинетический хромогенный метод

22.02.2012

Яна Гаклова (Jana Haklová), доктор наук
эксперт компании FAVEA

Введение

Кинетический хромогенный метод установления эндотоксинов при помощи LAL-теста описан в Европейской Фармакопее (ст. 2.6.14), в руководстве по проведению теста (ст. 5.1.10), а также в Фармакопее США (ст. 85) и руководстве FDA 1985 по валидации теста. В фармакопеях метод KQCL приводится как метод D.

Принцип испытания

При хромогенном испытании во время реакции эндотоксинов с лизатом происходит выделение цветного хромофора из бесцветного хромогенного субстрата. При кинетическом испытании измеряется время, необходимое для появления установленной абсорбции желтого красителя. Время реакции косвенно соответствует количеству присутствующих эндотоксинов. Проба соединяется со смесью хромогенного субстрата и лизата амебоцитов, и помещается для культивации при условиях, установленных производителем LAL-реактива (как правило 37 ± 1ºC). Эндотоксин, содержащийся в испытуемой пробе, активирует в лизате профермент, который в свою очередь способствует возникновению активного фермента. Фермент катализирует отщепление п-нитроанилина (pNA) в бесцветном субстрате. В ходе инкубационного периода проводят постоянное фотометрическое измерение высвобождаемого pNA при 405 нм. Концентрация эндотоксина в пробе расчитывается исходя из измеренного времени реакции в сравнении со временем реакции раствора с известным содержанием эндотоксинового стандарта (стандратная кривая).

Реакция:
Профермент -- Эндотоксин --> Фермент
Субстрат + H₂O -- Фермент --> Пептид + pNA

Реактивы и материалы

• Лизат с хромогенным субстратом
• Рабочий стандартный эндотоксин для калибровочного графика
• Вода для LAL-теста (вода для БЭТ)
• Буфер для устранения возможного интерференционного эффекта
• Блокатор глюканов при подозрении на присутствие глюканов в пробе
• Микротитрационная планшета
• Разбавительные пробирки (16x100 мм)
• Дозирующие регулируемые пипетки различного объема с наконечниками
• Мультидозатор с наконечниками
• Настольный шейкер
• Аналитические весы с точностью 0,01 мг
• УЗ баня для растворения проб
• Калиброванный цифровой таймер
• Ридер, компьютер, программное обеспечение, принтер. Ридер и софтвер должны быть прокалиброваны фирмой-поставщиком.

Вспомогательный материал не должен содержать эндотоксины, особенно это касается разбавительных пробирок и наконечников пипеток-дозаторов. Для реконституции проб используется вода для БЭТ с декларированным количеством ЭТ.

Отбор проб

Пробы сырья и воды, проверяемые на наличие бактериальных эндотоксинов, отбираются в закрытые непирогенные емкости.

Пробы готовой продукции, проверяемой на наличие эндотоксинов, отбираются в первичной упаковке согласно плану пробоотбора.

Подготовка отдельных проб регламентируется в процессе валидации испытуемого продукта.

Подготовка и хранение реактивов

Эндотоксин: сила эндотоксина указывается в МЕ (IU - International Units) = EU (Endotoxin Units – единицы эндотоксина).

Эндотоксин растворяется в апирогенной воде согласно инструкции производителя таким образом, чтобы получился базовый раствор эндотоксина (Std 5) с содержанием 50 МЕ/мл. Базовый раствор можно хранить в холодильнике при температуре 2-8ºC максимально 14 дней.

Другие стандартные растворы (St4 – St1) для калибровочного графика получают разведением базового раствора Std5 – см. табл. 1.

Последующие разведения хранить нельзя.

Лизат LAL: лиофилизированный лизат осторожно открывают и растворяют в указанном количестве воды для БЭТ и осторожно перемешивают вручную до полного растворения, избегая пенообразования. Лизат необходимо готовить непосредственно перед дозированием в отдельные ячейки микротитрационной планшеты. Растворенный лизат можно хранить 8 часов при 2-8 C без потери чувствительности. Лизат в растворе может храниться при менее -10 C максимально 2 недели. Замороженный лизат растворяется непосредственно перед применением. Заморозку и разморозку лизата можно делать только 1 раз.

Общая процедура

Перед измерением включается компьютер и задаются начальные данные. Программа требует ввести следующую информацию: шкалу паролей, обозначение теста, обозначение серии использованных реакционных компонентов и сроки годности (лизата, воды для БЭТ и эндотоксина), использованный материал, концентрации стандартов эндотоксинов и начальные данные всех измеренных проб и значение PPC (product positive control). Кинетический тест включает отрицательный контроль, которым является вода для БЭТ (BLANK) и восходящий ряд концентраций эндотоксинов для построения калибровочного графика, обозначенного Std1-Std5 (см. табл. 1). Калибровочная кривая и тестирование проб делаются одновременно в двух параллельных сериях. Установление интерференционных влияний проводится при помощи PPC (Product Positive Control) добавлением стандарта эндотоксина к пробе до конечной концентрации 0,5 МЕ/мл. PPC тест проводится в отдельных ячейках планшеты, в схеме дозирования обозначен перед номером пробы знаком +. После внесения начальных данных оператор распечатывает схему дозирования стандартов и образцов в ячейки микротитрационной планшеты (LAYOUT), которая служит в качестве руководства при непосредственном дозировании. Схема дозирования:

После включения ридера в процессе нагревания камеры до 37ºC дозируются компоненты на микротитрационную планшету. Дозируется по 100 µл следующим образом: в первые две ячейки, обозначенные A1 и A2 вода для БЭТ, в ячейки B1 и B2 - F1 и F2 растворы стандартов. Дозирование происходит постепенно, от низшей концентрации Std1 до Std5. Тестируемые пробы и PPC пробы дозируются всегда в следующие четыре ячейки (напр., G1, G2 и PPC тест +H1 и +H2). Для дозирования каждого стандарта и для дозирования каждой пробы всегда используется новый наконечник. Для установления PPC в ячейки, обозначенные на схеме знаком +, добавляется 10 µл стандарта Std4 .

Микротитрационная планшета с отмеренными компонентами вкладывается в ридер и активируется программа. От этого момента планшета инкубируется при 37ºC 10 мин. В это время рекомендуется готовить лизат. Через 10 мин. оператор получает сигнал о необходимости достать планшету и дозировать лизат. Во все занятые ячейки постепенно добавляется 100 µл лизата. Планшета вновь помещается в ридер и активируется непосредственно измерение.

Измерение оканчивается примерно через полтора часа и автоматически проводится оценка результатов теста. Калибровочный график оценивается линейной регрессией – методом наименьших квадратов, или полиномной моделью Power Curve. Главным критерием в обоих случаях является корреляционный коэффициент (CORR), угловой коэффициент (SLOPE), сдвиг по оси y (Y Intercept) и разница между двумя параллельно измеренными значениями в (%cv). Если абсолютное значение корреляционного коэффициента corr ≥ 0,98, предпочтение отдается PowerCurve, поскольку полиномная модель повышает точность прогноза концентрации эндотоксинов во всем множестве эндотоксиновых стандартов.

Оценка параметров калибровочного графика:

• Значение коэффициента корреляции (CORR) должно находиться в диапазоне от -0,98 до -1,00.
• Угловой коэффициент калибровочной кривой (SLOPE) должен находиться в пределах от -0,4 до -0,1.
• Сдвиг по оси y (Y Intercept) должен быть от 2,5 до 3,5.
• Разница двух измеренных значений (%cv) должна быть <10%.
• Измеренное значение РPC должно находиться в пределах 50%-200% значения фактически дозированных эндотоксинов.

Если какой-либо из параметров превысит установленное значение, в протоколе появится предупредительный сигнал об ошибке у данного значения (FAIL). В этом случае необходимо повторение анализа.

Этот общий способ используется при всех трех последующих испытаниях – квалификационном тесте комплекта, проверке интерференционных факторов и рутинном тесте.

Квалификационный тест комплекта

Тест проводится в соответствии с инструкцией производителя набора.

Подготавливается контрольный стандартный эндотоксин для калибровочного графика согласно табл. 1. Бланк и все точки калибровочной кривой применяются четыре раза. Конечный результата расчитывается как среднее полученных четырех значений.

Оценка квалификационного теста – параметры калибровочной кривой должны лежать в установленных пределах.

Таким образом подтверждается декларируемая чувствительность лизата у каждой новой серии. Так можно проверить и точность работы операторов.

Проверка на интерференционные факторы – валидация продукта

Валидация метода проводится для каждого нового продукта, у которого предписывается проверка бактериальных эндотоксинов и при каждом изменении (состав препарата, другой поставщик LAL-теста, изменение сырья, источника воды и т.д.). Предметом валидации является установление способа подготовки проб. Валидация проводится на трех сериях каждого препарата. Для обеспечения точности хромогенного анализа проводится предварительная проверка пригодности критериев для стандартной кривой и возможного наличия интерференционных свойств у проверяемого продукта.

Проба для установления предельной концентрации эндотоксинов кинетическим методом разбавляется так, чтобы концентрация эндотоксинов в пробе была выше значения наинизшей точки калибровочной кривой, т.е. 0,005 МЕ/мл. Разбавление проводится в связи с тем, что при более высоких концентрация проб как правило появляются нежелательные интерференционные влияния, негативно или позитивно влияющие на результаты анализа. При установлении оптимальной концентрации пробы необходимо учитывать максимальное утвержденное разведение пробы (MVD) – см. общую статью. В зависимости от рекомендаций производителей pH разбавленных проб должно находиться в пределах 6,0-8,0. При необходимости pH корректируется апирогенным раствором 0,1 N NaOH, или 0,1 N HCl.

Все точки калибровочного графика, в т.ч. бланка измеряются дважды. Анализируемые пробы в выбранном разведении измеряются дважды без и дважды с добавлением стандартного эндотоксина (PPC).

Оценка валидации

Параметры калибровочной кривой должны лежать в предписываемых границах

• Относительная стандартная ошибка %cv в двух параллельно устанавливаемых значениях времени реакции не должна превысить лимит 10% (выполнен критерий приемлемости).
• Корреляционный коэффициент CORR должен лежать в интервале от -1,0 до -0,98 (выполнен критерий линейности).
• Угловой коэффициент кривой SLOPE должен лежать в установленном интервале от -0,4 до -0,1.
• Сдвиг по оси y Y Intercept должен находиться в пределах 2,5-3,5.

Соответствие спецификации

• Проба считается удовлетворительной, если концентрация эндотоксинов меньше установленного лимита в МЕ/мг проверяемого вещества.
• Относительная стандартная ошибка времени реакции отдельных параллельных определений не должна быть более 10% (соблюден критерий точности).

Интерференция препарата при проверке

• Измеренные средние значения концентрации добавленных эндотоксинов в образцах РPC должны находиться в интервале 50%-200% значения фактически дозированного эндотоксина (селективный метод).
• Относительная стандартная ошибка РPC - %cv в отдельных параллельных измерениях времени реакции при измерении PPC не должна превысить установленный лимит 10% (соблюден критерий точности).
• Проверяемый препарат, или его примеси не должны иметь интерференционное влияние на установление концентрации эндотоксинов при условии, что было соблюдено максимальное утвержденное разведение MVD.

Устранение интерференции: если проверяемый препарат или его примеси интерферируют в пробе, интерференция может быть устранена приемлемым способом – разбавлением, фильтрацией или нагреванием. Разбавление проб должно быть в рамках MVD и проводиться водой для БЭТ, буфером или другим подходящим препаратом от поставщика LAL-теста.

Непосредственная проверка – рутинный тест

Все точки калибровочного графика измеряются дважды. Анализируемые пробы в разведении, которое было выбрано при валидации, измеряются дважды с, а дважды без добавления стандартного эндотоксина (PPC).

Оценка теста

• Параметры калибровочного графика должны лежать в установленных границах
• Проба соответствует требованиям, если концентрация эндотоксинов меньше, чем установленный лимит в МЕ/мг для проверяемого вещества.
• Относительная стандартная ошибка времени реакций отдельных параллельных измерений не должна быть больше 10% (соблюден критерий точности).